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| 产品介绍

转座子是基因组中一段具有自主复制和转位特性的独立DNA序列,在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间可以自行移动,通过切割、整合等过程从基因组的一个位置“跳跃”至另一位置。当转座子插入某段基因时,该基因的功能将被破坏,基于这样的特点,转座子经常被用于插入突变的实验中。

转座子插入测序(Transposon insertion sequencingTn-seq,又称为TIS)是一种高通量遗传筛选技术,结合了转座子高效随机插入的特点及高通量测序高效鉴定转座子插入位点的优点,可高效鉴定细菌在不同环境中的适应性基因。

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图 转座子插入测序原理[1]


通过在细菌中建立有效的随机转座子突变系统,可用于测定基因功能确定基因适应度探究基因间的遗传相互作用,从而解决各种生物学问题。

古天乐太阳娱乐集团tyc493推出高效转座子突变体库构建以及转座子突变体测序(Tn-seq)两款产品



产品一:古天乐太阳娱乐集团tyc493转座子突变体文库构建   


古天乐太阳娱乐集团tyc493目前主要针对的是非人畜致病菌以及革兰氏阴性菌,构建转座子突变体如果是革兰氏阳性菌,请提前联系古天乐太阳娱乐集团tyc493或者当地销售。

转座子突变体库构建步骤:

1、菌落培养:LB琼脂培养基平板上进行划线培养

2、菌落PCR挑选单个菌落进行菌落PCR(引物:27F-1429R

3、菌种鉴定:16s RNA进行测序(16s RNA全长)

4、感受态细胞制备;

4、电穿孔转化:通过与大肠杆菌连接进行转化

5、抗性平板涂布以及计数。

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转座子突变体库构建流程


| 结果交付:

1共进行了6次实验:每次15次转化每次约1万个菌落),总共60万个突变体菌落(6次)

2刮取所有细胞并混合均匀储存在-80℃20%甘油中(每1毫升放入1Eppendorf管,共50管)

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| 使用说明:

1、该突变体文库包含约100万突变体(突变体为Km抗性),实际插入位点以测序结果统计为准;

2、该突变体文库(甘油保存菌)至于干冰上快递寄送,公司将保留部分备份,以防运送途中失活;

3、此时的甘油保存菌是从平板上刮下来的菌体,包含较多细胞残渣及微弱生长的克隆,使用前须扩培;

4、正式实验前,取1管甘油保存菌(1ml),接种到新鲜培养液(300ml LB)至OD600大于1.0,甘油保存,用于后续实验。



古天乐太阳娱乐集团tyc493转座子突变体测序(Tn-seq)   


必需基因(essential genes)是指维持生物体生长和存活所必需的基因,必需基因往往参与DNA复制、转录、翻译等重要生物学基础代谢过程,在生物体内发挥着极其重要的作用。

当转座子插入必需基因的核心区域时就会造成细菌致死表型,因此我们可以通过转座子的插入频率(一般通过reads数推导)来判断基因的必需性,最终确定目标细菌的必需基因组。相比于传统全基因组敲除的方法,Tn-seq在必需基因鉴定方面具有更快的速度、更低的成本和更广泛的应用。

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Tn-seq分析必需基因[2]


| 分析示例:

表各基因覆盖的reads数量

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图 基因及含有转座酶引物序列在染色体上分布


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GO功能富集分析


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KEGG功能富集分析


参考文献

[1]Michael C. Chao, et al. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews, 14, 119-128 (2016).

[2]Cain AK, Barquist L, Goodman AL, et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. NatRev Genet 21, 526540 (2020).

[3]Su Y, Xu Y, Liang H, et al. Genome-Wide Identification of Ralstonia solanacearum Genes Required for Survival in Tomato Plants. mSystems. 2021.